Trompa de Falopio humana: una nueva fuente de células madre mesenquimales adultas multipotenciales desechadas en los procedimientos quir - El Hospital

Genómica
Trompa de Falopio humana: una nueva fuente de células madre mesenquimales adultas multipotenciales desechadas en los procedimientos quirúrgicos
Tatiana Jazedje, Mariane Secco, Daniela F. Bueno, Natassia M. Vieira, Eder Zucconi y Mayana Zatz, Paulo M. Perin, Mariangela Maluf , Silvio Halpern, Carlos E. Czeresnia, Diciembre 2009


Antecedentes: La posibilidad de utilizar células madre en medicina regenerativa ha abierto un nuevo campo de investigación. La búsqueda de fuentes para obtener células madre multipotenciales, a partir de tejidos desechados o a través de procedimientos no invasivos, es de gran interés. Se ha demostrado que las células madre mesenquimales (CMMs), obtenidas del cordón umbilical, la pulpa dentaria y el tejido adiposo, que son todos desechos biológicos, tienen la capacidad de diferenciarse en linajes de células de músculo, grasa, hueso y cartílago. El objetivo de este estudio fue aislar, expandir, caracterizar y evaluar el potencial de diferenciación de las CMMs de las trompas de Falopio humanas (TFhs). Métodos: Se expandieron los linajes de las TFhs, se analizaron sus cariotipos, se caracterizaron mediante citometría de flujo y se sometieron in vitro a diferenciación adipogénica, condrogénica, osteogénica y miogénica. Resultados: Nosotros demostramos aquí, por primera vez, que las TFhs, que son desechadas después de algunos procedimientos ginecológicos, son una fuente adicional rica en CMMs, a las cuales hemos denominado CMMs de las trompas humanas (thCMMs). Conclusión: Las CMMs de las trompas humanas pueden ser fácilmente aisladas, expandidas in vitro, presentan un perfil mesenquimal, y son capaces de diferenciarse in vitro en músculo, grasa, cartílago y hueso.

Journal of Translational Medicine, 2009, 7: 46 © 2009 Jazedje et al; licensee BioMed Central Ltd. Este es un artículo con Acceso Abierto distribuido bajo los términos de la Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se cite apropiadamente el trabajo original y se atribuya correctamente su autoría. Traducido por B2Bportales, Inc. a español, a partir del material original.

Antecedentes

Las células madre mesenquimales adultas (CMMs) se definen típicamente como células multipotenciales indiferenciadas, dotadas de la capacidad de autorrenovación y el potencial para diferenciarse en varios linajes de células distintos [1]. Estas células progenitoras, que constituyen un reservorio que se encuentra en el tejido conectivo de la mayoría de los órganos, están involucradas en el mantenimiento y la reparación de los tejidos durante toda la vida postnatal de un individuo. Aunque funcionalmente heterogéneas, las poblaciones de CMM aisladas de tejidos diferentes, como médula ósea, músculo esquelético, pulmón, tejido adiposo, pulpa dentaria, placenta y cordón umbilical, presentan un perfil similar de expresión de los receptores de superficie de las células [2-10]. Sin embargo, también es bien sabido que las células madre adultas se definen más por sus propiedades funcionales que por la expresión del marcador [11].

Nosotros y otros autores hemos demostrado recientemente que el cordón umbilical, la pulpa dentaria, el músculo orbicular de los labios y el tejido adiposo constituyen una fuente muy rica de CMMs, las cuales son capaces de diferenciarse en linajes de células musculares, cartilaginosas, óseas y adiposas [7, 10, 12- 15]. La extraordinaria capacidad regenerativa del endometrio humano después de la menstruación, en el período postparto, luego de procedimientos quirúrgicos (legrado uterino, ablación endometrial) y en las mujeres postmenopáusicas que reciben terapia de reemplazo hormonal, sugiere que nichos de CMM presentes en este tejido podrían ser los responsables de este proceso [16]. De hecho, recientemente fueron aisladas células madre derivadas del endometrio y la sangre menstrual, y estas demostraron la capacidad de diferenciarse en tipos de células de las tres capas germinales[17-23].

Las trompas de Falopio humanas (TFhs) comparten un mismo origen embriológico con el útero. Ellas tienen la capacidad de experimentar cambios inducidos por la dinámica endocrina durante el ciclo menstrual, que incluyen el crecimiento y la regeneración celular, con el fin de proporcionar el ambiente único necesario para el mantenimiento de la viabilidad de los gametos masculinos y femeninos, la fertilización, y el desarrollo temprano del embrión, así como su transporte hacia el útero [24]. Por lo tanto, con base en la experiencia de nuestro grupo de investigación en la identificación y caracterización de fuentes potenciales de células madre adultas [7, 10, 12-15], el objetivo de este estudio fue aislar, expandir, caracterizar y evaluar el potencial de diferenciación de las CMMs de las TFhs.

Métodos

Recolección y procesamiento de las trompas de Falopio humanas

Las trompas de Falopio humanas (n = 6) fueron obtenidas a partir de histerectomías o de muestras recolectadas en la ligadura/resección tubárica, durante la fase proliferativa de mujeres fértiles en edad reproductiva (rango: 35-53 años), que no habían recibido tratamiento hormonal exógeno por lo menos tres meses antes de la cirugía. Se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente y la aprobación otorgada por el comité de ética del Instituto de Biociencias de la Universidad de Sao Paulo. Todos los experimentos de laboratorio se llevaron a cabo en el Centro de Investigación del Genoma Humano de São Paulo, Brasil.

Cada muestra fue recolectada en un medio de Eagle modificado por Dulbecco, tamponado con HEPES/F-12 de Ham (DMEM/F-12; Invitrogen, Carlsbad, CA) o en un DMEM rico en glucosa (DMEM/High; Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con suero fetal bovino al 10% (FBS; HyClone, Logan, UT), mantenida a 4 °C y procesada dentro de un período de 24 horas. Todas las muestras de TFh fueron lavadas dos veces en tampón fosfato salino (PBS, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA), picadas finamente con un bisturí, introducidas en un tubo falcon de 15 ó 50 mL, e incubadas en 5 ml de TrypLE Express puro, (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 30 minutos, a 37 °C, en un baño de agua.

Posteriormente se retiró el sobrenadante con una pipeta Pasteur estéril, se lavaron las muestras una vez con 7 mL de DMEM/F-12 complementado con FBS al 10% en un falcon de 15 mL, y se sedimentaron por centrifugación a 400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Las células fueron sembradas después en DMEM/F-12 (5 mL) complementado con FBS al 10%, 100 UI/mL de penicilina (Invitrogen) y 100 UI/mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) en frascos de plástico (25 cm2), y mantenidas en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire a 37 °C. El medio de cultivo que se utilizó para la expansión fue cambiado inicialmente cada 72 horas y después fue reemplazado en forma rutinaria dos veces por semana.

Duplicación de la población y análisis cariotípico

Se llevaron a cabo experimentos de duplicación de la población (PD), para verificar la tasa de crecimiento de los linajes de células por lo menos por cinco días consecutivos, tanto durante el proceso de establecimiento como en periodos de tiempo prolongados. Para calcular la tasa de crecimiento se utilizó la metodología descrita previamente por Deasy et al. [25].

Se realizó un análisis cariotípico de las células de los mismos linajes sometidos a experimentos de PD, para verificar el mantenimiento de la normalidad cromosómica. Las células fueron cultivadas durante una hora en colchicina (0,1 μg/mL), separadas utilizando TrypLE Express (Invitrogen, Carlsbad, CA), lavadas en PBS (Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA) y resuspendidas en 0,5 mL de medio y mezcladas con 0,075 M de KCl a un volumen de 10 mL. Después de la incubación durante 20 minutos a 37 °C en un baño de agua, las células fueron centrifugadas a 400 g durante cinco minutos, y el sedimento fue fijado tres veces en 1 mL de fijador de Carnoy frío. Se fijaron tres gotas de suspensión de células en cada placa. Para el recuento de los cromosomas se tiñeron las placas con Giemsa durante 15 minutos y se fotografiaron en un microscopio de contraste de fases (Sistema Ikaros, Axiophot 2, Carl Zeiss, Jena, Alemania).

Análisis por citometría de flujo

El análisis por citometría de flujo se realizó con un citómetro de flujo microcapilar Guava EasyCyte (Guava Technologies, Hayward, CA), utilizando excitación láser y longitudes de onda de emisión de 488 y 532 nm, respectivamente. Las células fueron sedimentadas, resuspendidas en PBS (Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA) a una concentración de 1,0 × 105 células/mL y teñidas con concentraciones saturantes de anticuerpos. Después de 45 minutos de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente, las células fueron lavadas tres veces con PBS (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) y resuspendidas en 0,25 mL de PBS frío.

Con el fin de analizar la expresión de los marcadores proteicos típicos en la superficie celular, las células adherentes fueron tratadas con los siguientes anticuerpos primarios antihumanos: CD13-ficoeritrina [PE] (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), CD14 (VMRD Inc., Pullman, WA), CD29-PE-Cy5, CD31-PE, CD34-PerCP, CD38-isotiocianato de fluoresceína [FITC], CD44-FITC, CD45-FITC, CD73-PE, CD90-R-PE, CD117-PE (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), CD133-PE (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania), antígenos de leucocitos humanos (HLA)-ABC-FITC y HLA-DR-R-PE (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), SSEA4 (Chemicon, Temecula, CA), STRO1 (R&D Systems, Minneapolis, MN), y SH2, SH3 y SH4 (proporcionados amablemente por la Dra. Kerkis, del Instituto Butantan de Sao Paulo, Brasil). Se hicieron reaccionar los marcadores no conjugados con el anticuerpo secundario anti-ratón PE (Guava Technologies, Hayward, CA). Las células no teñidas fueron separadas en dispersión frontal para eliminar los restos de partículas y las células agrupadas. Para cada muestra se contaron por lo menos 5.000 eventos.

Diferenciación de las células madre mesenquimales

Para evaluar las propiedades de diferenciación de las CMM, las células adherentes (pasos 3 y 11) fueron sometidas in vitro a diferenciación adipogénica, condrogénica, osteogénica y miogénica, de acuerdo con los siguientes protocolos:

Diferenciación adipogénica

La capacidad de diferenciación adipogénica de las células de las TFhs expandidas por cultivo se determinó según lo informado anteriormente [26]. Las células de las TFhs expandidas por cultivo fueron cultivadas en un medio de proliferación complementado con 1 μM de dexametasona, 500 μM de 3-isobutil-1-metilxantina, 60 μM de indometacina y 5 μg/mL de insulina (Sigma-Aldrich, San Luis, MO). La confirmación de la diferenciación adipogénica se logró en el día 21 por la acumulación intracelular de vacuolas ricas en lípidos que se tiñen con oil red O (Sigma-Aldrich, San Luis, MO). Para la tinción con oil red O, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 minutos, lavadas, y teñidas con una solución activa de oil red O al 0,16% durante 20 minutos.

Diferenciación condrogénica

Se centrifugaron aproximadamente 2,5 ×105 TFhs en un tubo de poliestireno de 15 mL a 500 g durante cinco minutos, y se resuspendió el sedimento en 10 mL de medio basal. El medio basal consistió en DMEM/High (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con ITS-Premix al 1% (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 10 mM de dexametasona al 1% (Sigma-Aldrich, San Luis, MO), 100 mM de piruvato sódico al 1% (Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA) y 5 mM de ácido ascórbico-2 fosfato al 1% (Sigma-Aldrich, San Luis, MO). Sin alterar el sedimento, se resuspendieron las células en 0,5 mL de medio de diferenciación condrogénica, que consistió en el medio basal complementado con 10 ng/mL de factor de crecimiento transformante (TGF) β1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) y FBS al 10%, y se mantuvieron en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire a 37 °C.

El primer día se voltearon suavemente los tubos para obtener una sola esfera flotante de células. Se cambió el medio cada tres o cuatro días. En el día 21 se fijaron las muestras en formalina al 10% durante 24 horas a 4 °C y se incrustaron en parafina. Se cortaron criosecciones (5 μm de espesor) de las micromasas recolectadas y se tiρeron con azul de toluidina para demostrar la matriz extracelular de mucopolisacáridos [14].

Diferenciación osteogénica

La diferenciación osteogénica se obtuvo al cultivar las células de las TFhs en DMEM bajo en glucosa (DMEM/LG; Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 0,1 mM de dexametasona y 50 mM de ácido ascórbico-2 fosfato (ambos de Sigma-Aldrich, San Luis, MO), y mantenerlas en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire a 37 °C. En el día nueve se adicionaron 10 mM de β-glicerofosfato para inducir la mineralización. La diferenciación osteogénica se demostró mediante la formación de áreas positivas de hidroxiapatita de calcio (tinción de von Kossa) en el día 21. Después de dos lavados con PBS (Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA) y uno con agua destilada, las células fueron incubadas en nitrato de plata al 1% (Sigma-Aldrich, San Luis, MO) bajo luz ultravioleta durante 45 minutos, y posteriormente fueron incubadas en tiosulfato de sodio al 3% (Sigma-Aldrich, San Luis, MO) durante 5 minutos. Finalmente, se realizó una contratinción con Van Gieson [14]. La acumulación de calcio fue indicada por un color oscuro.

Diferenciación miogénica

Para la diferenciación miogénica se cultivaron las células de las TFhs en un medio de diferenciación miogénica, compuesto por 50% de medio de inducción y 50% de DMEM fresco/F-12 (Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con FBS al 10% (HyClone, Logan, UT) en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire a 37 °C.

El medio de proliferación, que consistió en DMEM/F-12, complementado con FBS al 10%, 100 UI/mL de penicilina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 100 UI/mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), es, de hecho, el mismo medio que se utilizó previamente para cultivar los mioblastos humanos primarios durante 48 horas. Antes de su uso se filtró el medio de inducción a través de un filtro de membrana con poros de 0,22 μm (Millipore, Billerica, MA) y se ajustó el pH con bicarbonato de sodio (Sigma-Aldrich, San Luis, MO). Se cultivaron las CMM de las TFh durante 40 días y se cambió el medio dos veces por semana. Después de este intervalo, se analizaron las células utilizando pruebas de inmunofluorescencia (IF) y Western Blot (WB).

Análisis de inmunofluorescencia y Western Blot

Inmunofluorescencia. La localización de la distrofina mediante IF en las células de las TFhs diferenciadas en músculo se llevó a cabo para confirmar la diferenciación miogénica. Las células fueron lavadas dos veces con PBS frío (Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA), fijadas con PFA/PBS al 4% durante 20 minutos a 4 °C y permeabilizadas con Triton X-100 al 0,05% (TX-100; Sigma-Aldrich, San Luis, MO) en PBS (Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA) por cinco minutos. Después de bloquear los enlaces inespecíficos del FBS/PBS al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante una hora a temperatura ambiente, se hicieron incubaciones con el anticuerpo primario (anti-distrofina; Ab15277; Abcam, Cambridge, UK) durante toda la noche a 4 °C y con el anticuerpo secundario (FITC IgG; Chemicon, Temecula, CA) durante una hora a temperatura ambiente. Se contratiñeron los núcleos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma-Aldrich, San Luis, MO) para su visualización. Como controles positivos, nosotros usamos miotubos humanos diferenciados normales. Como controles negativos, utilizamos CMMth no diferenciadas. Las placas de inmunofluorescencia fueron examinadas utilizando un microscopio Axiovert 200 (Axio Imager Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).

Western Blot. Las proteínas de las células de las TFhs diferenciadas en músculo fueron extraídas mediante tratamiento con un buffer que contenía 10 mM de Tris-HCL [pH 8.0], 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, TX-100 al 1% y 60 mM de octil glucósido (Sigma-Aldrich, San Luis, MO). Se centrifugaron las muestras a 13.000 g durante 10 minutos para remover los restos insolubles. Las proteínas fueron separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE al 6%) y transferidas a membranas de nitrocelulosa (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Todas las membranas fueron teñidas con Ponceau S al 0,2% (Sigma-Aldrich), para evaluar la cantidad de proteínas cargadas. Se bloquearon las membranas durante una hora a temperatura ambiente con leche en polvo al 5% en solución salina tamponada de Tris con detergente Tween 20 (TBST, 20 mM de Tris-HCL, 500 mM de NaCl, Tween 20 al ,05%) y se trataron durante toda la noche con anticuerpos primarios anti-distrofina (VP-D508; Vector Laboratories, Burlingame, CA) y anti-miosina esquelética (M7523; Sigma-Aldrich, San Luis, MO). Al día siguiente se incubaron las membranas por una hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios IG anti-ratón y anti-conejo peroxidasa-conjugados (GE Healthcare, Piscataway, NJ), según lo recomendado por el fabricante. Se detectaron bandas inmunorreactivas al utilizar el sistema de detección de quimioluminiscencia realzada (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Resultados

Expansión de linajes, duplicación de la población y análisis de cariotipos



Figura 1. Morfología de las células adherentes aisladas de las TFhs (cultivos primarios). A) Células cultivadas por tres días después de la siembra inicial. Células con un fenotipo similar al de las CMM y un pequeño racimo de células de apariencia endotelial (flechas) (100×). B) Células cultivadas por seis días después de la siembra inicial (100×). C) Células cultivadas por seis días después de la siembra inicial (400×) (Microscopio Zeiss Axiovert 200).



Después de sembrar las células de las TFhs, se observaron diferentes tipos de células, pero la mayoría de ellas eran fusiformes, parecidas a los fibroblastos. También se pudieron observar algunos racimos de células de apariencia endotelial, débilmente esparcidas (figura 1).


Figura 2. Duplicación de la población y análisis cariotípico. Panel A) Resultados del linaje de las FThs en el paso dos. Panel B) Resultados del linaje de las TFhs en el paso 11. Nosotros observamos altas tasas de división celular, con una disminución gradual del tiempo de duplicación de la población (PDT) en los linajes cultivados por largo tiempo. A pesar de eso, no se observó ninguna evidencia de anomalía cromosómica (Sistema Ikaros, Axiophot 2, Carl Zeiss).



Después de la primera disociación enzimática, por lo general entre los 5 y 7 días de cultivo, se constituyeron capas de células adherentes homogéneas con un fenotipo similar al de las CMM. Todos los linajes fueron expandidos, congelados y descongelados varias veces. Los experimentos de PD mostraron altas tasas de división celular, y los análisis cariotípicos no demostraron ninguna evidencia de anomalías cromosómicas (figura 2).

Análisis por citometría de flujo
Ninguna de las células adherentes derivadas de las TFhs expresó marcadores de linaje hematopoyético (CD34, CD38, CD45, CD117 y CD133), marcador endotelial CD31 ni marcador de monocitos (CD14). Además, la mayoría de las células expresaron niveles altos de marcadores de adhesión (CD29, CD44 y CD90) y marcadores de CMM (CD13, CD73, SH2, SH3 y SH4). Las células aisladas de las TFh también fueron positivas para HLA-clase I (HLA-ABC), pero fueron negativas para HLA-clase II (HLA-DR), y así mismo fueron negativas para el factor SSEA4 de las células madre embrionarias y para el supuesto marcador de CMM, Stro-1.



Figura 3. Análisis de las thCMMs por citometría



Para hacer una investigación comparativa, proporcionamos un análisis por citometría de TFh recién digeridas y sin cultivar, en el cual utilizamos nueve marcadores de CMM (CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, Stro-1, SH2, SH3 y SH4), así como marcadores tisulares específicos (CD14, CD31 y CD34). El análisis por citometría, que está resumido en la figura 3, muestra el perfil mesenquimal de las células TFhs. Adicionalmente, las propiedades de CMM de las células aisladas fueron confirmadas después mediante estudios de diferenciación celular. Sorpresivamente, el CD29 y el CD44 se expresaron en forma positiva en las CMMth y en las TFh recién digeridas y sin cultivar.


Figura 4. Diferenciación multilinaje in vitro...



Diferenciación multilinaje

La plasticidad de las células adherentes obtenidas de las TFhs fue evaluada tres semanas después de la inducción mesodérmica de la diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica. La diferenciación multilinaje se realizó para cinco linajes independientes de thCMMs, y entre ellos no se observó ninguna diferencia evidente en su potencial de diferenciación. Además, después de 40 días de cultivo en el medio de inducción, se investigó el potencial de las células TFhs para diferenciarse en células músculo-esqueléticas. La diferenciación miogénica se demostró mediante la expresión de marcadores miogénicos (miosina y distrofina). Las células de las TFhs se diferenciaron in vitro en tejidos miogénicos, adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos (figura 4). Juntos, estos resultados confirmaron la naturaleza mesenquimal de las células aisladas y su multipotencialidad.

Discusión

La posibilidad de utilizar células madre en medicina regenerativa ha abierto un nuevo campo de investigación, para encontrar las mejores fuentes para la obtención de células madre multipotenciales, en particular a través de procedimientos no invasivos.

Nuevas evidencias sugieren que las CMMs, definidas al inicio como precursoras de la medula ósea, están presentes prácticamente en todos los órganos y desempeñan un papel quizás importante en el mantenimiento y la regeneración tisular [27-31]. Más recientemente, estas también fueron halladas en el endometrio uterino humano y en la sangre menstrual, y se ha demostrado que son capaces de promover la regeneración in vivo [16, 18, 19, 21, 22, 32, 33]. Un estudio reciente demostró el aislamiento de células madre a partir del endometrio y la promoción de condrogénesis in vitro [20].

Se ha demostrado que las CMMs obtenidas del cordón umbilical, la pulpa dentaria, el tejido adiposo y la sangre menstrual, que son todos desechos biológicos, son capaces de diferenciarse en linajes celulares de músculo, grasa, hueso y cartílago [7, 10, 12, 15]. Nosotros demostramos aquí por primera vez que las TFhs, que se desechan en procedimientos de histerectomía, son una fuente adicional rica en CMMs, a la que denominamos CMMs de las trompas humanas (thCMMs). Los pasos tempranos de las thCMMs presentaron tiempos de PD más largos (aproximadamente 15 horas). Sin embargo, con los pasos adicionales, los tiempos de PD se acortaron y se estabilizaron. Aunque las thCMMs proliferan en forma considerable en los cultivos, el análisis comparativo de los cariotipos de las células de los pasos tempranos (segundo) y tardíos (decimoprimero) no mostraron anomalías, lo que sugiere una estabilidad cromosómica a lo largo de todos los pasos.

Aunque Nasef et al. sugieren que una población purificada enriquecida con Stro-1 aumenta el efecto supresor en el trasplante alogénico, Murphy et al. demostraron que las células regenerativas endometriales alogénicas (CRE o células madre mesenquimales de la sangre menstrual), que son Stro-1 negativas, fueron eficaces para el tratamiento de la isquemia crítica de las extremidades en las ratas [34, 32]. En concordancia con estudios recientes en el endometrio humano, las thCMMs también son Stro-1 negativas [35]. Por otra parte, el CD44, que se considera un marcador de las CMMs y ha demostrado ser crítico en el reclutamiento de CMMs para la regeneración tisular en los sitios de las heridas, se expresó altamente en las thCMMs y también en los tejidos recién digeridos de las trompas de Falopio [36, 37]. La CD29, una integrina involucrada en la adhesión de las células, también se expresó altamente en todos los linajes de thCMMs estudiados, incluyendo las muestras recién digeridas. Curiosamente, de acuerdo con las evidencias de estudios recientes, esta molécula puede estar involucrada en el proceso de fertilización, al permitir la unión y la fusión del espermatozoide y el óvulo [38].

Sin embargo, la especulación acerca de que las thCMMs pueden desempeñar un papel en la reproducción aún está por ser dilucidada. De todos modos, los altos niveles de expresión de los marcadores de adhesión (CD29, CD44 y CD90) y de otros marcadores de CMM (CD13, CD73, SH2, SH3 y SH4), junto con los resultados de la diferenciación multilinaje, confirmaron la naturaleza mesenquimal de las células madre de las trompas de Falopio humanas. Estas características importantes implican que las thCMMs representan una población celular que puede ser expandida rápidamente para posibles aplicaciones clínicas.

La integridad morfológica y funcional del epitelio tubárico es de primordial importancia para el desarrollo de un microambiente único necesario para la óptima fertilización y el desarrollo temprano del embrión. Por consiguiente, es esencial para la implantación exitosa, como lo evidencia un meta-análisis reciente, que muestra que el uso de células oviductales humanas para co-cultivo mejora la morfología del embrión, las tasas de implantación y el éxito del embarazo [39].

Anatómicamente, las TFhs están divididas en cuatro segmentos diferentes (intramural, ístmico, ampular e infundíbulo/fimbria), cada uno compuesto por diferentes poblaciones de células epiteliales y con distintas actividades secretoras [40]. Las bacterias y virus que se encuentran en forma constante en el lumen de la vagina pueden introducirse esporádicamente en el tracto reproductivo superior e interrumpir la integridad del epitelio de las TFhs, y representan un factor de riesgo significativo para la salud reproductiva femenina. La necesidad de una homeostasis estricta del medio ambiente de las TFh, con el fin de evitar la interrupción de la función reproductiva, sugiere que los nichos de CMM presentes en este tejido podrían ser los responsables de este proceso [41, 42].

Recientemente, Wolff et al. pudieron demostrar la presencia de células endometriales multipotenciales mediante la inducción in vitro de diferenciación condrogénica de una subpoblación de células del estroma endometrial [20]. Sin embargo, al utilizar como controles tejidos ginecológicos no endometriales, tales como miometrio, trompas de Falopio y ligamentos uterosacros, ellos no pudieron demostrar la condrogénesis. Esto sugiere que pueden existir menos células madre progenitoras en estos tejidos, debido a su menor carga de regeneración durante la vida, en comparación con la del endometrio, o a que la prueba de diferenciación que se empleó para su estudio no fue apropiada para esos tejidos. Con base en nuestro éxito en la obtención de diferenciación miogénica, adipogénica, osteogénica y condrogénica, a partir de las thCMMs, podemos suponer que la imposibilidad de demostrar condrogénesis en el tejido de las trompas de Falopio, reportada por Wolff et al., podría estar relacionada más con cuestiones metodológicas que con la concentración de células madre progenitoras.

Conclusión

Los fragmentos de tejido humano que usualmente son desechados en los procedimientos quirúrgicos pueden representar fuentes importantes de células madre y su uso no plantea problemas éticos. Este es el primer estudio realizado para demostrar el aislamiento, la expansión in vitro y la diferenciación en músculo, grasa, cartílago y hueso de una nueva fuente rica en células progenitoras mesenquimales, a partir de las TFhs adultas normales.

Los fragmentos de tejido de las TFhs, que por lo general son desechados después de los procedimientos quirúrgicos, pueden representar una nueva fuente potencial de células pluripotenciales para la medicina regenerativa. La identificación de nichos de células madre de tejidos específicos en las TFhs, capaces de reemplazar a las células diferenciadas dañadas, puede contribuir a proporcionar el medio ambiente único necesario para el mantenimiento de la viabilidad de los gametos masculinos y femeninos, la fertilización y el desarrollo temprano del embrión y su transporte hacia el útero, que en conjunto son necesarios para un desenlace reproductivo exitoso.

Intereses competitivos

Los autores declaran que no tienen ningún interés competitivo.

Contribuciones de los autores

TJ y MZ concibieron el estudio. PMP, CEC, MM y SH suministraron las trompas obtenidas de procedimientos quirúrgicos. TJ, MZ, PMP, CEC, MM y SH escribieron el manuscrito. TJ diseñó y realizó los cultivos de tejidos, Western Blotting y la inmunofluorescencia. MS, EZ y NMV colaboraron con la evaluación por citometría de flujo y con la revisión del manuscrito. DFB contribuyó con la diferenciación osteogénica y condrogénica. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Agradecimientos

Queremos agradecer: a la Dra. Marília Trierveiler, por el análisis condrogénico y las fotografías; a las Dras. Célia Koiffmann y Cláudia I. E. de Castro, por el análisis de cariotipos y las fotografías; a Marta Cánovas, por su apoyo técnico; a la Dra. Mariz Vainzof, por el análisis WB y las sugerencias; a la Dra. Irina Kerkis, por el suministro de anticuerpos; a Marcos Valadares y Maria Denise Fernandes Carvalho, por el apoyo con los cultivos; a la Sra. Constancia Urbani, por la asistencia secretarial; a FAPESP/CEPID, CNPq y FUSP.

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Acerca del autor
Tatiana Jazedje, Mariane Secco, Daniela F. Bueno, Natassia M. Vieira, Eder Zucconi y Mayana Zatz,
Centro de Investigación del Genoma Humano, Instituto de Biociencias, Universidad de São Paulo, Brasil.

Paulo M. Perin, Mariangela Maluf , Silvio Halpern,
CEERH - Centro Especializado en Reproducción Humana, São Paulo, Brasil.

Carlos E. Czeresnia,
Celula Mater, São Paulo, Brasil.

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