CRISPR/Cas9 se postula como herramienta en el déficit de alfa-1-antitripsina

Un proyecto indaga en el interés de la terapia génica para abordar el déficit de alfa-1-antitripsina.

Enrique Mezquita. Valencia | 21/11/2017 14:15

Luis Sendra, Salvador F. Aliño y María José Herrero, investigadores del proyecto DAAT. (Enrique Mezquita)

El déficit de alfa-1-antitripsina (DAAT) es una enfermedad genética definida por la deficiencia o ausencia de una proteína que protege frente al daño en pulmones e hígado. Se considera una patología rara e infradiagnosticada y se estima que la prevalencia en España es de alrededor de 22 casos por cada 100.000 habitantes. Si los pacientes no reciben el tratamiento adecuado, puede derivar en enfisema pulmonar en adultos y en enfermedad hepática, en el caso de los niños. Según un proyecto de investigación de Luis Sendra, investigador del Grupo de Farmacogenética del Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Universitario y Politécnico La Fe de Valencia (IIS-La Fe), la terapia génica podría jugar un papel importante en su tratamiento, ya que la transferencia génica hidrodinámica podría mediar la implementación del gen AAT, mejorando así el daño pulmonar al aumentar la concentración plasmática de proteína normal o la reparación del gen con interés clínico en el tratamiento del DAAT. Este proyecto ha ganado el premio internacional ALTA (Alpha-1 Antitrypsin Laurell's Training Award), impulsado por Grifols y con una dotación de 50.000 euros.

El punto de partida será evaluar el interés de la terapia génica en el tratamiento del DAAT empleando estrategias de implementación y edición génica mediante la técnica CRISPR/Cas9, sobre todo teniendo en cuenta que dicha patología representa una diana atractiva para este campo al tratarse de una enfermedad hereditaria monogénica.

"Nuestro grupo lleva a cabo dos líneas principales de investigación, farmacogenética y terapia génica, y este proyecto se se enmarca en la segunda. En este ámbito, el grupo tiene una larga trayectoria investigadora iniciada hace más de 20 años en la Universidad de Valencia por Salvador F. Aliño, jefe del grupo, catedrático de farmacología de la UV y farmacólogo clínico del Hospital La Fe. En primer lugar se estudiaron mecanismos de entrega de fármacos como los liposomas y posteriormente se aplicó esta estrategia a la entrega de ADN en la que ya se utilizó el gen de la alfa-1-antitripsina (AAT). A partir la descripción del procedimiento hidrodinámico de entrega génica (utilizando una solución salina como vehículo) en 1999, el grupo adoptó esta estrategia para la entrega génica hepática del gen AAT en ratones", ha explicado Sendra. En 2003, un trabajo del grupo mostró que el procedimiento hidrodinámico de transferencia génica utilizando el gen humano AAT en ratones mediaba unos niveles plasmáticos terapéuticos de la proteína durante periodos superiores a los 6 meses. Desde este momento, los esfuerzos del grupo se han centrado en la traslación clínica del procedimiento para evaluar el interés potencial de su uso en humanos. En este sentido, se han realizado trabajos (publicados en revistas científicas internacionales) en modelo animal porcino desarrollando diferentes técnicas radiológicas y quirúrgicas con el fin de aislar vascularmente el hígado y así incrementar la tasa de entrega del gen AAT.

"El modelo de ratón mostró que el procedimiento tiene potencial para ser terapéutico. Sin embargo, todos los intentos para trasladar la estrategia a animales de mayor tamaño obtuvieron unos resultados menos alentadores. Esto se debía principalmente al hecho de que las condiciones de la inyección debían ser suavizadas para evitar reacciones adversas hemodinámicas. El trabajo de varios grupos concluyó que para aumentar la eficiencia se debían diseñar modelos que permitieran aislar vascularmente el hígado in vivo. Siguiendo esta directriz, hemos desarrollado modelos de presurización hepática ‘in vivo' en cerdo mediante técnicas quirúrgicas y radiológicas intervencionistas, en colaboración con las unidades de trasplante hepático y de radiología intervencionista de La Fe, respectivamente", y con ellos se ha demostrado que el procedimiento media una entrega del ADN similar a la mostrada en ratones tratados exitosamente y una expresión tisular de la proteína en niveles ligeramente inferiores. Sin embargo, la proteína no alcanza la sangre donde debe llegar para alcanzar otros tejidos donde ejerce principalmente su función. "Pensamos que esto es debido a diferencias en la estructura proteica humana y porcina, que dificulta la salida de la proteína al torrente sanguíneo. Por este motivo, creemos que el procedimiento tiene potencial y es posible que esta limitación se supere al utilizar tejido humano y en el presente proyecto lo evaluaremos, utilizando el gen hAAT marcado con una secuencia flag para diferenciar la AAT endógena de la exógena".

Siguiente paso

El siguiente paso será evaluar la posibilidad de mediar mutaciones de inserción o deleción y la reparación de mutaciones específicas en lugar específico frecuentes en el DAAT mediante el sistema CRISPR/Cas9 en cultivos celulares humanos, lo cual permitirá determinar el porcentaje de células con reparación de la mutación. Por último, se evaluará en segmentos hepáticos humanos ex vivo la eficiencia y especificidad de edición génica de la construcción CRISPR que haya mediado los mejores resultados in vitro, transferida mediante el procedimiento hidrodinámico. Respecto a los resultados, se espera obtener el corte y edición (corrección de la mutación) en un porcentaje de células suficientes para producir niveles adecuados de la proteína correcta. "Tras los resultados obtenidos en ratón pensamos que alrededor de un 1-3% de las células con el gen AAT funcional sería suficiente para producir niveles plasmáticos terapéuticos de la proteína. Además, se pretende que las construcciones CRISPR/Cas9 no produzcan efectos ‘off-target', es decir, en otros lugares del genoma". De obtenerse estos resultados, "su aplicación clínica podría ser evaluada dado el interés de la estrategia para el tratamiento de múltiples patologías hereditaria de carácter monogénico".

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En enfermeda monogénica

El potencial de la técnica CRISPR/Cas9 es enorme y ha dado un gran impulso y una nueva dimensión al campo de la terapia génica y la biología molecular. Se trata de una estrategia que, de alguna manera, ha democratizado la aplicación de la reparación génica, ya que es relativamente económica y adaptable a las necesidades de cada laboratorio.

Sin embargo, en la actualidad deben resolverse aún muchas preguntas y limitaciones como en cualquier estrategia terapéutica que se está desarrollando. Quedan por resolvercuestiones relacionadas con su seguridad (mutaciones off-target), eficiencia de entrega (que ha resultado ser menor de los esperado en algunos tipos celulares) para alcanzar un mínimo de células que medien una respuesta terapéutica, así como de modos de aplicación terapéutica y de modulación del periodo de su efecto (en algunos casos será necesario un efecto permanente, mientras que en otros será mejor limitar el tiempo de su efecto, y por ello se están desarrollando caspasas sin capacidad de corte del ADN para que bloqueen la expresión de un gen de manera temporal y no induzcan modificaciones en la secuencia del genoma).

Respecto a sus aplicaciones, las enfermedades hereditarias monogénicas con mutaciones puntuales en lugares conocidos son dianas idóneas para esta estrategia ya que se podría diseñar un CRISPR/Cas9 específico para esa región del ADN e inducir una corrección específica en el lugar se la mutación. Sin embargo, gracias a las mejoras y adaptaciones de las caspasas para modular sus efectos, cada vez tendrán más aplicaciones. En cualquier caso, según los especialistas, hay que ser cauto, estudiar bien y resolver todas las limitaciones que conllevan antes de su aplicación clínica.